酶标探针

酶作为检测探针已经使用了多年，并且由于其简单、灵敏和广谱的应用，即使随着荧光探针的兴起，酶仍然被广泛使用。酶探针，包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），用于通过显色、化学发光或荧光输出检测靶蛋白。这些读数的可变性证明了酶探针在生物学研究方法中的多功能性，包括免疫组织化学（IHC）、免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）。

常见的ELISA实验。在该测定中，通过直接吸附到测定板上或通过首先将捕获抗体附着到板表面来固定感兴趣的抗原。然后可以使用酶缀合的一级抗体（直接检测）或一组匹配的未标记的一级和缀合的二级抗体（间接检测）来进行抗原的检测。

酶探针简介

酶作为检测探针报告物

酶用于通过与另一种蛋白质或小分子缀合来检测感兴趣的靶标，所述另一种蛋白或小分子例如一级或二级抗体、生物素、阿维丁或与靶标结合的一些其他蛋白质或小分子。下图描述了在典型的免疫测定中可能发生的与抗体结合的阿维丁-生物素复合物。然后引入特定酶的底物，其与酶相互作用以形成可见的反应产物，该反应产物可以是深色沉淀物或发光或荧光。然后通过显微镜或扫描方法检测该信号。

使用酶探针检测靶蛋白的优势有三点：

高灵敏度—可以很容易地检测信号输出，因此可以识别低浓度的目标分子。此外，可以使用信号放大方法，显著增加到达靶分子位点的酶分子的数量。最后，酶探针表现出快速周转，这增加了单个酶在给定单位时间内转化的底物量。

保质期长—适当储存时，酶非常稳定，虽然酶底物对光敏感，但酶本身对环境光降解不敏感。

输出多功能性—可产生显色、化学发光或荧光输出的底物可用于最常见的酶探针。

尽管这些优点证明了酶探针的多功能性和便利性，但在选择合适类型的检测探针时，应考虑其使用的局限性：

大尺寸—酶探针比有机荧光化合物（如FITC、TRITC和AMCA）大得多，因此可能干扰与其结合的蛋白质的生物功能。

底物要求—酶探针需要添加用于蛋白质检测的底物，并且根据所使用的底物，该反应可能对环境条件（如光照、温度）和环境光敏感。

内源性干扰—用于检测样品中靶蛋白的酶通常在所用的实验系统（如组织、细胞）中表达，除非受到抑制，否则也会处理底物并产生非特异性背景信号。

常见的酶的探针报告剂和显色底物

酶通过与底物反应产生可测量的有色、荧光或化学发光信号，起到检测报告剂的作用。下表列出了几种常用的酶和底物，它们可以是可溶性的，也可以是沉淀性的。该图提供了生物素在显色检测中的应用实例。

生物素显色检测。组织、细胞、转移到膜上的或者结合于多孔细胞培养板上的抗原先与一抗结合，后者再与生物素标记的二抗结合；按照适当比例将链亲和素和生物素标记的碱性磷酸酶混合，形成网络状的SABC-AP 复合物；接着二抗上标记的生物素再与SABC-AP结合，加入AP底物进行显色即可检测到相应的信号。其中链亲和素和Biotin-AP混合后形成网络状复合物是信号能被放大的关键，相当于一个待检测的生物素分子通过SABC-AP复合物的识别最终可以由很多个AP分子来显示其信号，从而达到了信号放大的效果。

常见的酶的探针报告剂和显色底物

酶通过与底物反应产生可测量的有色、荧光或化学发光信号，起到检测报告剂的作用。底物可以是可溶的，也可以是沉淀的。

酶探针的应用

酶探针由于其多功能性、与许多不同种类的大分子偶联的能力以及底物的可用性和可变性而被广泛应用于许多不同的实验应用中。酶最常用于通过直接和间接抗体检测策略检测蛋白质，其中酶分别与结合靶蛋白的第一抗体或靶向第一抗体的第二抗体偶联。该酶也可以与生物素或阿维丁缀合，用于阿维丁-生物素信号扩增系统。

使用沉淀底物的显色检测是用于免疫组织化学（IHC）的一种常见的蛋白质靶向类型，尽管近年来随着技术进步和荧光检测仪器的增加，荧光探针的使用有所增加。化学发光底物是通过蛋白质印迹分析进行蛋白质检测的标准，因为其检测的灵敏度高且线性范围广。沉淀发色底物和近年来的荧光底物也可用于该应用。化学发光、荧光和可溶性显色ELISA底物是常用的，每种底物都表现出不同实验策略的特异性。

直接和间接蛋白质检测。靶蛋白结合和固定的表面是膜（蛋白质印迹）或微孔板（ELISA）。

探针的酶报告剂

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP）催化两个电子从底物转移到过氧化氢，产生氧化的底物和水。对于蛋白质检测，HRP底物（列于下表）被设计为在氧化时产生显色、化学发光或荧光信号。HRP的分子量为40000，与其他酶缀合物相比相对较小。这种小尺寸允许更大程度地渗透到样品组织和细胞中，并降低干扰结合蛋白功能的可能性。HRP还具有可用于缀合的四种赖氨酸，这提高了交联到感兴趣的蛋白质的效率。

HRP具有高周转率，并在生理pH（7.6）下在短时间内产生丰富的反应产物。HRP-IgG偶联物优于碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶偶联物，因为它们具有更高的特异性酶活性（更多的HRP/摩尔抗体）和免疫反应性（由于HRP的大小，空间位阻较小）。

与HRP的使用相关的主要问题之一是由某些组织中的内源性过氧化物活性引起的非特异性染色。低温切片通常含有大量的内源性过氧化物酶活性，尽管商业过氧化物酶抑制剂可用于降低或消除内源性过氧化物酶活力，但HRP是石蜡包埋切片染色的酶标记，这是一种抑制内源性活性的方法。

HRP的第二个缺点是它对微生物降解的敏感性以及用于对抗微生物的抗菌剂。叠氮化钠是HRP的有效抑制剂，但该酶可以储存在0.01%硫柳汞中。氰化物、硫化物和叠氮化物也会抑制HRP。HRP的最后一个缺点是一些辣根过氧化物酶底物的反应产物具有诱变性或致癌性。如果这些问题中的任何一个是主要问题，那么其他酶标记物可能是优选的。

HisProbe-HRP探针的检测机制。 HisProbe- HRP是一种镍（Ni2+）激活的辣根过氧化物酶（HRP）衍生物，能够直接、固定化金属亲和色谱（IMAC）检测蛋白质印迹和微孔板中His标记的蛋白质和其他富含组氨酸的蛋白质。

碱性磷酸酶

碱性磷酸酶（AP）是一个分布广泛的酶家族，可从核苷酸和蛋白质中水解磷酸盐。最佳酶活性在pH 9.0-9.6之间；这些酶被二价阳离子激活，并被半胱氨酸、氰化物、砷酸盐、无机磷酸盐和二价阳离子螯合剂（如EDTA）抑制。

哺乳动物体内有两种形式的碱性磷酸酶；一种形式分布在各种组织中，另一种仅在肠道中发现。抑制剂和热灭活剂对这两种形式的影响不同。在底物缓冲液中使用1mM左旋咪唑将抑制内源性组织碱性磷酸酶活性。肠道碱性磷酸酶活性可通过在4°C下用20%乙酸染色15秒（或用2.3%碘酸染色5分钟），然后用0.02%硼氢化钾染色2分钟来抑制切片。

小牛肠碱性磷酸酶缀合物在高内源性过氧化物酶水平禁止使用HRP缀合物的应用中是理想的，例如在过氧化物酶抑制剂无效的冷冻切片中。

当用作标签时，小牛肠道碱性磷酸酶（分子量140000）比其他酶具有几个明显的优势。因为反应速率保持线性，所以可以通过允许反应进行更长的时间来提高灵敏度。小牛肠道碱性磷酸酶的活性不受叠氮化钠或硫柳汞等抗菌剂的影响，因此可能会在非无菌环境中长期储存。由于1mM左旋咪唑可以抑制非肠道碱性磷酸酶的内源性活性，因此用这种酶标记的抗体可以在许多不同的组织中用作标记。

葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶是从黑曲霉中分离出来的一种酶，对β-D-葡萄糖氧化产生过氧化氢和葡萄糖酸进行催化。葡萄糖氧化酶是一种二聚体糖蛋白，分子量为160000。葡萄糖氧化酶抑制剂包括Ag+、Hg2+、Cu2+、对氯苯甲酸汞和乙酸苯汞。

葡萄糖氧化酶通常是具有高内源性过氧化物酶或磷酸酶活性的样品的选择标签，因为哺乳动物组织中没有内源性葡萄糖氧化酶活性。然而，选择具有低过氧化氢酶活性的葡萄糖氧化酶是重要的，因为过氧化氢酶会破坏反应中的过氧化氢最终产物。

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一种从大肠杆菌中分离出来的酶，能够水解多种吡喃半乳糖苷衍生物，产生水溶性和水不溶性产物。NaCl是一种激活剂，Mg2+是该酶的辅因子，β-半乳糖苷酶的最适pH为7.0-7.5。对于免疫组织化学染色，可以通过用石蜡包埋样品来克服内源性酶的潜在干扰。

β-半乳糖苷酶在哺乳动物细胞中是敏感的，并且没有表现出内源性活性，因此它在内源性酶活性是一个持续问题的应用中是有用的。β-半乳糖苷酶已通过多种交联剂成功偶联到IgG片段、全免疫球蛋白和胰岛素上。β-半乳糖苷酶的一个缺点是缺乏底物的多样性。

基质类型

显色底物

显色底物已被广泛使用多年，并提供了最简单、最具成本效益的检测方法。基于酶-底物反应产物的性质，将这些底物分为两组。当沉淀与适当酶接触的底物时，它们转化为不溶性产物，沉淀到样品或膜上。由于这些产物的不溶性，沉淀底物通常用于IHC和蛋白质印迹。该代表性数据提供了关于使用HRP缀合的抗体和TMB溶液产生的显色蛋白质印迹的详细信息。

制备HeLa细胞裂解物的系列稀释液（7.5、3.45、1.88、0.94、0.47、0.23和0.12μg），并通过电泳进行分离。将蛋白质转移到硝化纤维膜上，并用TBS+0.05%Thermo Scientific Tween 20中的5%脱脂乳封闭膜。封闭后，将膜与热休克蛋白86多克隆抗体以0.5μg/mL孵育。洗涤膜，然后与0.2μg/mL HRP缀合的山羊抗兔IgG孵育，然后再次洗涤。将膜置于10mL的1-步Ultra-TMB印迹溶液中，并通过用水冲洗膜在5分钟时停止显色。

相反，溶解在测试溶液中的可溶性底物水溶性有色产物通常用于ELISA测定。除了产品性质的差异外，这两种类型的显色底物在使用的检测仪器上也有所不同。沉淀基质不需要比光学显微镜更专业的设备来检测不溶性产物的存在、强度和定位，同时使用微孔板读数器来测量吸光度，从而测量溶液中可溶性产物的量。显色印迹底物有多种规格和格式，适当的底物选择取决于酶标记、所需灵敏度和所需信号或检测方法的形式。

对于任何一种类型的显色底物，蛋白质检测都类似于显影膜；将样品在基质中孵育直到显色令人满意，之后停止反应和/或测量产物的量。这种方法允许用户控制数据的分辨率。然而，显色底物的低灵敏度使得检测低丰度蛋白质的优化变得困难；尽管反应可以发展几个小时甚至一夜，但这也允许背景信号的发展。当显色底物在灵敏度方面失败时，它们是蛋白质丰度高的应用的理想选择。该信号是稳定的，因为底物反应的产物在适当储存时是稳定的。因此，显色底物通常不会出现假阴性结果的问题，而假阴性结果可能会在化学发光底物的免疫印迹中发生（例如，重影带）。

显色底物通常用于检测丰富的蛋白质，并且可以直观地监测反应的发展；与化学发光或荧光印迹系统相比，这允许更大的优化灵活性。然而，当从不同的供应商处获得特定基质时，其性能可能会发生显著变化，因为基质的浓度和纯度以及作为配方一部分的其他添加剂和缓冲组分会影响其性能。

化学发光基质

化学发光底物之所以受欢迎，是因为它们比其他检测方法具有一些优势，包括大的线性响应范围，可以检测和定量各种蛋白质浓度。鲁米诺是最常用的化学发光试剂之一；鲁米诺被过氧化物氧化，形成激发态3-氨基邻苯二甲酸酯，该激发态通过释放波长为425nm的光子而衰变为低能态。

化学发光底物与其他底物的不同之处在于，检测到的光是仅在酶底物反应发生时存在的反应的瞬态产物。这与产生稳定着色产品的显色基质形成对比。在化学发光反应中，底物是反应中的限制试剂；当它耗尽时，光的产生减少并最终停止。使用适当的酶缀合物稀释液进行优化的程序将在数小时内产生稳定的光输出，从而实现对蛋白质的一致和灵敏检测。

化学发光底物通常用于通过使用x射线胶片、荧光成像器或CCD相机的蛋白质印迹分析进行蛋白质检测的短期、快速检测。

荧光基质

虽然荧光团标记的抗体和其他分子更常用于检测靶蛋白，但荧光底物也可用于酶检测。这些底物在被酶探针代谢之前保持无荧光或发射低荧光，之后它们发射强荧光。由于荧光显微镜成像、荧光微板读数器和分析软件，这些底物提供了更高的灵敏度和快速定量能力。

酶标记

已经开发了几种方法，并常规用于制备抗体或其他与酶如HRP和AP的蛋白质缀合物。所有种类的酶缀合的二级抗体都是市售的，但专门的一级抗体和其他蛋白质探针可能必须由研究人员标记。

戊二醛是用于蛋白质偶联的最简单的交联试剂之一。它与胺基反应，通过几种途径之一产生交联。在还原条件下，戊二醛两端的醛与胺偶联形成仲胺键。该试剂在蛋白质缀合方面是高效的，但有形成各种高分子量聚合物的趋势，使得结果难以重现。

高碘酸盐活化后再进行还原胺化是HRP和其他糖蛋白结合的极好策略。用高碘酸盐处理糖基化酶会导致糖顺式二醇基团（尤其是唾液酸，它在糖蛋白多糖中很常见）的氧化，从而形成醛基。然后，这些醛基将有效地（在温和还原剂氰基硼氢化物的存在下）与添加的抗体或其他分子的伯胺反应。结果是通过永久的酰胺键进行稳定的结合。

醛（羰基）作为交联目标。高碘酸钠与糖残基的反应产生用于共轭反应的醛。R和R’表示多糖的连接糖单体。红色星号表示二醇裂解位点。唾液酸也被称为N-乙酰-D-神经氨酸。

参考文献

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