反应性 | H M R Mk |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 15 到 20 |
来源 | 兔 |
应用关键词:
- WB- 蛋白质印迹法
- IP-免疫沉淀法
- IHC-免疫组织化学法
- ChIP-染色质免疫沉淀法
- C&R - CUT&RUN
- C&T - CUT&Tag
- DB - 点印迹
- eCLIP - eCLIP
- IF-免疫荧光法
- F-流式细胞术
物种交叉反应性关键词:
- H-人
- M-小鼠
- R-大鼠
- Hm- 仓鼠
- Mk-猴
- Vir- 病毒
- Mi-水貂
- C-鸡
- Dm-黑腹果蝇
- X-爪蟾
- Z-斑马鱼
- B-牛
- DG-犬
- PG-猪
- Sc-酿酒酵母
- Ce-秀丽隐杆线虫
- Hr-马
- GP-豚鼠
- Rab-Rabbit
- All-预期所有物种
产品使用信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
保存
蛋白质印迹法实验步骤
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
A. 溶液与试剂
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
- 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
- 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
- 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
- 脱脂奶粉:(#9999)。
- 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
- 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
- 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
- Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
- 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
- HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
- 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
- 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
- 微量离心机内离心 5 分钟。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
- 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。
C. 膜封闭和抗体孵育
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
I. 膜封闭
- (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
- 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
II. 一抗孵育
- 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody ,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 继续进行检测(D 部分)。
D. 蛋白质检测
使用说明:
- 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
- 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent 。混匀。
- 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
特异性/灵敏度
物种反应性:
人, 小鼠, 大鼠, 猴
来源/纯化
使用与小鼠 4E-BP1 中 Thr37 和 Thr46 周围的残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。通过蛋白质 A 和肽亲和色谱纯化抗体。
背景
翻译抑制蛋白 4E-BP1(也称为 PHAS-1)可通过结合翻译起始因子 eIF4E 抑制帽子结构依赖性翻译。4E-BP1 的高度磷酸化会扰乱这种相互作用,进而导致帽子结构依赖性翻译被激活 (1)。PI3 激酶/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶均可调节 4E-BP1 活性 (2,3)。多个 4E-BP1 残基在体内被磷酸化 (4)。一般认为FRAP/mTOR 在 Thr37 和 Thr46 的磷酸化虽然不会阻碍 4E-BP1 与 eIF4E的结合,但会引导4E-BP1 后续在 Ser65 和 Thr70 的磷酸化 (5)。
相关文档
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