一般方案

Dihydroethidium 工作液的制备

1.1 储备液的制备

取1mg Dihydroethidium 于0.31mL DMSO中，得到10mM Dihydroethidium。

注意：建议储备液在 -20℃或 -80℃避光保存，避免反复冻融。

1.2 Dihydroethidium 工作液的制备

稀释在无血清细胞培养基或PBS中加入1-10 μM的 Dihydroethidium 工作液。

注意：请根据实际情况调整 Dihydroethidium 工作液的浓度。

细胞染色

2.1 悬浮细胞：4℃，1000g离心3-5分钟，弃上清。PBS洗涤2次，每次5分钟。

贴壁细胞：弃去细胞培养基，加入胰蛋白酶解离细胞，制成单细胞悬液。在 4°C 下以 1000 g 离心 3-5 分钟，然后弃去上清液。PBS洗涤2次，每次5分钟。

2.2 加入1mL Dihydroethidium 工作液，室温孵育30分钟。

2.3 4℃，400g离心3-4分钟，弃上清。

2.4 PBS洗涤2次，每次5分钟。

2.5 用无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，荧光显微镜或流式细胞仪检测。

储存

-20°C，1年

避光

注意事项

1. 建议将原液储存于 -20℃或 -80℃避光，避免反复冻融。

2.请根据实际情况调整 Dihydroethidium 工作液的浓度。

3.本品供研发使用

4. 为了您的安全和健康，请穿着实验服和一次性手套操作。

Dihydroethidium是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针。可以直接用于活细胞的标记。Dihydroethidium被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生ethidium。Ethidium (例如溴化乙锭)可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。这样就可以用dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测。

Dihydroethidium本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发射波长为610nm，实际观察时也可以使用535nm作为激发波长。

用于细胞内超氧化物阴离子检测时，Dihydroethidium的常用浓度为1-10μM。通常用含有0.5-5μM的Dihydroethidium的适当溶液和细胞一起在37℃孵育30分钟左右进行荧光探针装载，随后可以适当洗涤，接着可以直接用流式细胞仪或其它适当荧光检测仪器进行检测。

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  Description: Dihydroethidium is a superoxide indicator with red fluorescence, it can be used to detect ROS production.
  Method: For the detection of ROS production in liver tissues.
  1. Frozen sections of liver tissues in each group (5-μm-thick) are prepared and incubated with Dihydroethidium (7.5 mM; 30 min; 37°C; dark).
  2. The sections are observed using a fluorescence microscope (Leica, Germany) and the percentage of Dihydroethidiumpositive cells is calculated through a quantitative morphometric analysis.
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  Description: Dihydroethidium is a superoxide indicator, it can be used to detect superoxide anion production. Dihydroethidium specifically reacts with intracellular superoxide anion and turns into ethidium in nuclei with red fluorescence.
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  Description: Dihydroethidium is a superoxide indicator with red fluorescence, it can be used for the estimation of reactive oxygen species (ROS) levels.
  Method: For paraffin sections staining.
  1. Paraffin sections (5 μM) are used to measure retinal and choroidal ROS production with Dihydroethidium (5 μmol/L; 20 min; 37°C).
  2. To confirm the specificity of Dihydroethidium staining, eye slides are preincubated with 100 U/mL polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase (30 min; 37°C).
  3. Use an Olympus DP73 fluorescence microscope (Tokyo, Japan) and Image J-NIH freeware to measure the intensity of staining.
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  Description: Dihydroethidium is a superoxide indicator with red fluorescence, it can be used to indicate the ROS accumulation.
  Method: For brain sections staining.
  1. Incubate brain sections in 10 μM Dihydroethidium solution (1 h; 37°C; dark).
  2. Wash sections with PBS for 3 times.
  3. Samples are mounted with neutral balata and observed with the fluorescent microscope (Carl Zeiss, Weimar, Germany)and the positive area is calculated using Image J.

*下述溶液配置方法仅为基于分子量计算出的理论值。不同产品在配置溶液前，需考虑其在不同溶剂中的溶解度限制。

不同实验动物依据体表面积的等效剂量转换表（参考来源于公开文献）

例如，依据体表面积折算法，将化合物用于小鼠的剂量20 mg/kg 换算成大鼠的剂量，需要将20 mg/kg 乘以小鼠的K_m系数（3），再除以大鼠的K_m系数（6），得到化合物用于大鼠的等效剂量为10 mg/kg。

常温常压下稳定，避免与强氧化剂接触。

密封储存，储存于阴凉、干燥的库房。冷藏温度为-20ºC。